Modelul experimental. Principalul instrument de studiu utilizat pentru atingerea obiectivelor propuse va fi modelul experimental stabilit de colectivul nostru pe parcursul unor etape preliminare, sistem ce vizeaza reproducerea in vitro a micromediului medular tumoral. Acesta consta in co-cultivarea celulelor mielomatoase cu celule stromale derivate din probe de maduva osoasa hematogena. Celulele stromale din maduva pot fi separate de celulele hematopoietice pe baza capacitatii lor particulare de a adera la suprafete de plastic. In scopul obtinerii culturilor de celule stromale, cultivam probele de aspirat medular heparinizat in mediu alpha minimum essential medium [alpha MEM], in flaskuri de 750 ml, la 37oC, in atmosfera cu 95% aer si 5% CO2. Dupa sapte zile, indepartam celulele neaderente si inlocuim mediul la fiecare sapte zile. Dupa obtinerea unei confluente bogate, subcultivam celulele in raport de 1/3 si continuam pana la cel putin trei pasaje. Dupa cel putin trei pasaje, celulele stromale se detaseaza prin digestie enzimatica (Tripsina-EDTA) si se stocheaza la -70oC. La desprinderea finala confirmarea fenotipului celulelor stromale se face prin citometrie in flux, pe baza expresiei markerilor definitorii acestei categorii celulare: CD73, CD90, CD105 si pentru stabilirea a unui pattern de expresie a moleculelor de adeziune (CD44, CD45, CD49d, CD49f, CD 54, CD58) inainte si dupa co-cultura. Partenerul mielomatos al co-culturilor in sistemul nostru experimental este reprezentat atat de linii celulare de mielom (L363, U266, RPMI8226), cat si de celule CD138 pozitive separate magnetic din probele de aspirat medular de la pacientii cu MM. Caracterizarea fenotipica a celulelor MM si aprecierea puritatii suspensiei celulare dupa separare se face pe baza expresiei CD38, CD138 si CD56, prin citometrie in flux. Co-cultura celor doua tipuri de celule are loc in placi de 24 de godeuri in care 1x10e5 celule MM sunt cultivate pe plaje de stromale, intr-un ml de mediu/godeu. In cel de al doilea an (2009) va fi introdus un element nou, hipoxia, in acest sistem de co-cultura, prin utilizarea unui dispozitiv de reglare a concentratiei atmosferice de O2 . Acest dispozitiv va fi achizitionat din fondurile obtinute pentru gestionarea acestui proiect. In ultimii doi ani de desfasurare a proiectului vor fi folosite amble sisteme (+/- hipoxie) in paralel, ceea ce va permite efectuarea de studii comparative, in vederea validarii unui sistem imbunatatit de studiu in vitro al celulei mielmatoase in cadrul micromediului tumoral.

Evaluarea cailor de semnalizare activate in celulele MM consecutiv interactiunii cu stroma medulara. Dupa cum am detaliat in sectiunea 10.1, exista trei cai implicate in semnalizarea supravietuirii (inhibarii apoptozei) si proliferari celulare: PI3K/Akt, Ras/MAPK si JAK/STAT. Intentionam sa investigam nivelul a cate doua componente (proteine fosforilate) ale fiecarei cascade enzimatice implicate in transmiterea semnalelor antiapoptotice furnizate de micromediu, si anume phospho- (p-) p38, p-ERK1/2, p-JNK1/2, p-AKT, p-STAT1, p-STAT3. Exista doua metode alternative pentru investigarea nivelului acestor proteine fosforilate: Western blot (developare enzimatica) si citometrie in flux. Vor fi folosite ambele metode, atat din considerente de verificare a reproductibilitatii rezultatelor, cat si pentru avantajele complementare ale acestor tehnici. In cel de al treilea an (2010) al desfasurarii proiectului colectivul nostru va fi in masura, pe baza datelor acumulate in primii doi ani, sa selecteze elementele cheie care intervin in transmiterea semnalelor anti-apoptotice si sa decida asupra utilizarii inhibitorilor specifici, disponibili comercial. In scopul evaluarii efectului protector exercitat de prezenta plajelor confluente de celule stromale asupra celulelor mielomatoase si a modului in care acesta este alterat de prezenta inhibitorilor, se vor utiliza tehnici de citometrie in flux pentru masurarea viabilitatii (incorporare de 7-Amino-Actinomycin D, 7-AAD) proliferarii (prin masurarea nivelului de carboxi-fluorescein-succinimidil-ester, CFSE), si apoptozei (anexinV/PI). Fiecare etapa majora, detaliata in sectiunea 12.1 se va finaliza cu evaluarea comparativa (prin aplicarea metodelor de calcul statistic) a rezultatelor furnizate de analiza celulelor de MM (fenotip, patern de expresie a moleculelor de adeziune, continut al componentelor fosforilate ale cailor de transmitere a semnalului anti-apoptotic, evaluarea procesului de apoptoza, evaluare proliferarii celulare) inainte si dupa co-cultivare; efectuarea statistica a testelor comparative: normoxie versus hipoxie; evaluarea comparativa, statistica, a rezultatelor obtinute prin utilizarea inhibitorilor.